POCT蛋白质生物传感器的需求
用于蛋白质多重检测的光学检测平台的评估以及对临床使用的即时护理生物传感器的需求
抽象
关键词：体外
1.简介：满足临床需要的多重生物标志物检测
在诸如基因组学，蛋白质组学和代谢组技术进步提高了我们的疾病引发，疾病进展和治疗反应的基本机制的了解，帮助确定在个性化医疗[有用的生物标记1 - 3]。这些生物标记物（例如蛋白质）可以用作诊断，预后或治疗指标，并且通常代表替代或替代临床终点的替代终点。用于生物标志物测量的新型设备的开发对于个性化医学领域非常重要，该术语以多种方式定义。本评价的目的，个性化药物被定义为提供最好的治疗特定于患者的个体的基因组，或蛋白质组图谱，以指导更安全和更有效的治疗方法[ 4 - 6 ]。在细胞水平上有关患者组成的信息可以提供有关适当药物，相关药物剂量，疾病状态或疾病预防方法的线索[ 4]。个性化医疗的最终目标是实现“ 5 Rs”：（1）合适的患者；（2）正确诊断；（三）正确处理；（4）正确的药物/靶标；（5）正确的剂量/时间。只能通过结合临床医学方法，完成全面的病史以及利用适当测试（例如体外诊断设备）中的数据来实现此目标。尽管5Rs代表了医疗保健的理想选择，但在实践中进行正确的诊断仍然存在许多问题，因为这些因素取决于测试的准确性和所患疾病的普遍性。实际上，对于临床医生而言，阳性和阴性预测值比测试的敏感性和特异性更为重要[ 7 ]。
体外诊断（IVD）是一种检测方法，可探测从患者（尿液，血液，鼻拭子等）采集的样本中的分子，基因组，表观基因组或蛋白质组学种类，以帮助临床诊断，预测或治疗选择[ 8] ]。与治疗剂并行开发的特定IVD，并按照药物和设备标签上的说明相互结合使用，称为同伴诊断[ 6 ]。特定的分析物的IVD探针认为是“生物标志物”，如果他们可以客观地测量和评价和指示正常或致病生物过程或药理响应于特定的治疗性干预[ 6，9]。生物标志物主要分为三类：（1）暴露的生物标志物（例如，疾病的诊断/鉴定或预测对治疗的反应）；（2）易感性（例如，区分患有惰性疾病或侵袭性疾病的患者）；（3）毒性（例如，识别可能产生不良副作用的患者）[ 10 ]。理想情况下，IVD应该具有高通量，快速且能够实时检测多种生物标志物的能力。个性化药物的IVD还应与特定药物或药物组合配对，这些药物或药物组合应能够安全有效地治疗患者且不良反应最小[ 11 ]。
1.1。蛋白质复合检测的意义
科学界在复用越来越大的兴趣（多分析物的同时检测），这在过去十年[中开发11 ]。多重化很重要，因为疾病和治疗反应通常涉及许多生物过程之间的相互作用，因此涉及蛋白质而不是单个实体[ 11 ]。DNA和蛋白质微阵列，确定新的生物标志物一直至关重要，将继续在他们的常规检测[发挥显著作用4，5，12 - 16]。为了研究疾病的生物学基础，已经进行了许多努力，但是基因表达与疾病发作之间的关系仍然不清楚。然而，人们越来越了解蛋白质谱与疾病发作之间的关系[ 17 ]。由于只有大约25,000的蛋白质的多个变体的人类基因组和基因编码的基因，研究人员经常使用蛋白质组学，而不是基因，深入了解疾病[ 18 ]和新的分析工具可以协助这一进程[ 5，6]。多重化对于免疫测定非常重要，例如，一种生物化学技术，该技术使用抗体来测量样品中存在的特定大分子的量。由于抗体是由于人体对病毒，细菌和其他危害的免疫反应而产生的，因此将这些生物分子用于检测目的可实现出色的特异性和敏感性[ 18 ]。使用免疫测定已检测到低至10 -21摩尔/ L的浓度[ 18 ]。复用可以提高吞吐量并增加数据生成，同时简化格式并减少操作测试所需的时间和成本[ 19 ]。
1.2。临床上多重使用的重要性
多重传感器的使用可以使许多科学领域受益，但是本综述的重点是询问用于临床用途或个性化医学的多重生物传感器的开发。对于临床和诊断目的，开发用于临床实践的多重生物传感器至关重要，因为鉴定和定量生物标志物（表明正常或致病性生物学过程的分析物）都很重要[ 20 ]。同时测量许多不同的蛋白质是有用的，因为一种生物标志物可能表明一种以上的疾病，相关疾病可以表现出相似的物理症状，并且监测疾病需要随着时间的推移检测出细微的差异[ 21 ]。
基于对许多生物标志物的评估，多路复用传感器有可能通过减少对潜在无效的有毒药物治疗的暴露来革新患者的治疗方法[ 22 ]。此外，如果出现以下情况，多路传感器可以帮助预防疾病和延长寿命：在早期诊断，在特定时期内对患者进行多次筛查，并且仅为患者开出最佳疗法。
用于蛋白质多路复用的标准技术当前不适用于护理点（POC）环境。小体积分析物的检测与体积受限的组织活检特别相关。在临床实验室中，抗体研究需要0.5 mL血清，每次测定需要0.15 mL [ 23 ]。对于某些重症，新生儿或儿科患者，所需的血清量可能无法进行分析。但是，如果可以将样本小型化并在POC上使用，则对于多重分析而言，样本大小就不那么重要了。
1.3。POC生物传感器在医疗保健领域的优势
POC设备在医疗保健领域很有用，因为它可以用于在患者仍在医生办公室时确认患者的诊断（例如，基于临床检查确认诊断）。如果患者具有传染性或需要立即治疗，则通过实施定量测试快速确认临床发现尤其重要。例如，用于检测性传播感染的标准实验室测试通常需要2到14天才能获得结果，而预期的POC测试时间为20分钟，而POC测试的理想周转时间为5分钟[ 24]。模型POC设备将需要单个测试样本，一组人员来处理和分析该样本，以及需要采集患者血液或尿液的单个时间点。这些好处可以帮助增加患者进行重复护理或发现测试结果的可能性，从而提高所提供的护理水平。
在临床实践中，确定生物标志物的存在通常需要使用多种不同类型技术的各种实验室测试和设备。对于单个诊断，许多实验室和人员可以参与处理每个测试。一次诊断需要分析样品的实验室和人员越多，结果相关的不确定性就越大。诸如酶联免疫吸附测定（ELISA）之类的典型测定可以检测单个分析物，但是可以使用一种统一的测试方法，使用多重POC装置同时探测许多生物标志物，从而使每种分析物获得的数据具有更大的一致性。此外，当使用与多路POC装置相同的测试方法和样品时，确定生物标记之间的关系更容易，更可靠。多路复用提高了检测和定量的速度，因为来自样本的信号可以直接与背景噪声和位于同一设备上的控件进行比较，因此更加简单。多重POC分析所需的时间，成本和劳动更少，并且样本量更小；样品量通常与测试的分析物数量无关，仅取决于所使用的检测技术[25 ]。
2. POC使用的传感器要求
生物传感器由国际纯粹与应用化学家联合会（IUPAC）定义为一种独立的设备，该设备使用与转导元件直接接触的生物识别元件（例如抗体或核酸）提供定量分析信息。11 ]。换句话说，生物传感器通过使用生物受体来检测分析物，使用传感器将识别事件转换为信号的传感器以及包括分析和处理的检测系统，使用生物系统将目标物质与样品中的其他成分区分开来。 [ 18 ]。理想的POC设备体积小，便携式，成本效益高，精度高，维护成本低，易于使用，坚固且在不同环境条件下均稳定[ 23]。该设备还应要求最少的用户界面，快速的周转时间和高吞吐量的能力。POC设备的规格对于将检测的所有方面（采样，测试和检测）集成到一个手持式平台上以创建真正的生物传感器[ 26 ] 至关重要。诸如检测限（LOD），特异性，灵敏度，可重复性，可靠性，鲁棒性，成本，速度和多路复用能力之类的设备属性对于可在POC环境中使用的生物传感器的设计至关重要。
适当设计的IVD可用作POC诊断，可在医生办公室或家中使用，并可减少所需的时间，样品量和试剂量以及测试的总成本。由于许多POC体外诊断测量一种分析物，是均匀的且易于使用（例如葡萄糖测试条或家用怀孕测试）时，它们往往只需要一个混合/样品添加步骤和一个检测步骤[ 8，27，28]。因此，这些类型的化验有可能被小型化并整合到高通量多重设备POC设备中。按照目前的设计，涉及微量滴定板的标准技术不适合POC环境，因为它们很复杂，需要多个步骤并需要受过训练的人员进行操作。
2.1。小样本量
使用这种小体积的（数百μL的），因为样品的大体积（几毫升）可能不能从某些患者，如婴儿或所使用的危重[是用于医疗实践重要20，21，25 ]或从所有样本类型，例如组织活检或脑脊液[ 29 – 34 ]。少量（100μL）的样品摄入可以使用从患者手指获取的毛细血管血而不是静脉血，这需要抽血医生的协助。此外，当患者的肾脏受损时，尿液的生成可能会受到抑制，因此对少量液体进行测试可能会有用[ 35 ]。
标准的96孔微量滴定板免疫测定（例如ELISA）每孔需要50-100μL样品或试剂[ 36 ]。然而，小型化的免疫测定法已在许多格式，包括三明治和反相格式使用显微镜载玻片上进行，这些平台通常需要在高微到毫升范围内的样品体积进行操作[ 37 - 40 ]。
对于家庭护理或其他“使用点”应用，设备的尺寸必须相对较小（不比蜂窝电话大很多）。因此，检测分析物所需的样品量应≤50μL。但是，对于可以进行小型化的多重分析，样品的大小不是一个问题。努力小型化测定具有涉及微流体，实验室上的单芯片技术，以及改进的激励和检测方法[ 8，27，28，41 ]。
小样本量具有重要的优势，因为在生物流体（例如血浆和尿液）中进行实验时，基质效应对测定的影响可能较小[ 18 ]。每个包含分析物浓度的不同样本量可能会提供不同的结果。但是，在小样品中，反应中样品的比例较低，因此可以减少基质效应的影响，并提高了准确度。因此，与常规方法相比，使用小样本量的POC分析可能更敏感。但是，小样本量也可能带来风险，因为取决于浓度，还可能无法检测到分析物。
2.2。检测系统
能够进行多重蛋白质检测的两种常用荧光测定法是标准微量滴定板荧光测定法和Luminex 100/200。复用蛋白质检测的这些标准的光学方法常常需要较大的仪器，训练有素的人员，并且必须在典型的实验室环境来执行。42，43 ]。相反，POC设备具有许多优势，例如维护成本低和便携性高。虽然微型的ELISA和基于芯片的流式细胞术已被证明作为证明的概念，没有这样的装置已经被商业化，所以开发一种生物传感器POC的需要仍然是最重要的[ 44 - 46 ]。
为了创建较小的检测系统，可以将用于免疫测定平台的生物标记信号分析方法与电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）相机耦合，尤其是用于荧光检测系统[ 47 ]。在这种设置中，可以使用发光二极管（LED）或小型激光二极管作为激发源，但是LED可能比激光更有利，而激光必须经过较大的距离才能移动。除非激光引起全内反射，否则它会照亮整个表面。如果该设备是便携式，一次性的，具有成本效益的，需要最少的用户交互，并且满足临床需要以小体积获取有关分析物的相关信息[ 23]，医生可以比现有技术更快地做出诊断，预后或治疗决策[ 21 ]。检测系统的尺寸范围可以从手机的尺寸（约14 cm×7 cm×1 cm）到笔的尺寸（约15 cm×1 cm×1 cm），具体取决于所使用的技术。某些POC设备需要连接到计算机屏幕，从而使其更大。
微流体和实验室上的单芯片技术可以应用到的PoC应用程序来支持小型化，自动化和测定组分（例如，检测）的整合以创建手持设备[ 8，26 ]。已经证明微流体可用于免疫测定，例如，固定有抗体的微珠可用于检测分析物[ 48 ]。自动化，无论是通过使用微流体技术还是其他技术，都可以提高测定的性能，鲁棒性和可靠性[ 49]。理想的POC设备会将实验程序和检测系统结合到一个集成的，功能齐全的独立设备中，该设备需要最少的用户交互，并具有数字读数以帮助解释结果。侧向流动测试如妊娠试验，这是由许多患者和临床医生认为是最好的POC原型，表示一种易于使用，易于阅读的POC设备，结合了采样和检测[ 7，24 ]。
3.蛋白质检测
当前，有许多不同的方法以多重方式检测蛋白质，例如通过电化学，光度，机械[ 50 ]或压电[ 51 ]手段。一些生物传感器是由纳米材料组成的[ 52 ]，而另一些则使用微悬臂梁[ 53 ]，但是所有的检测方法都涉及基于标记或无标记的技术[ 54 ]。光学传感器[ 55 ]，例如表面等离子体共振[ 56 ]或质谱[ 57，58与其他许多检测策略相比，它具有优势，因为它们不受电化学和电磁源的干扰，能够进行实时检测[ 59 ]，并且适用于芯片实验室格式。这些生物传感策略的当前问题包括相对于某些应用的需求而言，检测极限不足，灵敏度低，特异性低。此外，许多生物传感器无法以自动化方式同时检测不同的分析物[ 51 ]。蛋白质检测的黄金标准是ELISA，它可以使用比色，拉曼，荧光或发光技术测量不同孔中的多个靶标（即空间分离）[ 11]。复用策略主要有两种类型：在表面上进行空间分离（即，不同的孔或斑点），以及使用唯一的标识符/标记（即，由于不同的有色染料或珠子大小/颜色而导致的光谱分离）。
当前用于蛋白质检测的多种多重方法依赖于免疫测定。免疫测定是一种生化技术，使用抗体来测量样品中存在的特定大分子的量。免疫测定法的一些优势在于，它们可用于以很高的特异性和敏感性检测指示疾病的抗原[ 18 ]。但是，免疫测定法易于在捕获抗体之间发生交叉反应，特别是当目标抗原以不同的浓度范围存在时[ 11 ]。免疫测定还可能由于基质效应而降低灵敏度。生物素是维生素B的基本成分，而抗生物素蛋白是白蛋白中常见的一种蛋白质[ 60]，通常在检测步骤或竞争性检测形式中通常用作许多免疫检测和其他技术的检测方法[ 61 – 63 ]。抗生物素蛋白-生物素复合物是已知最强的非共价相互作用之一（Ka〜1015 M-1），常用于传感应用[ 64 – 67 ]
以下各节描述了用于蛋白质多路复用的主要光学技术。但是，通常使用的一种技术是质谱法，它不是光学技术。质谱分析技术可用于分析蛋白质混合物并定量数千种蛋白质[ 68]。在离子化分析物的气相中进行测量。质谱仪由三部分组成：一个用于离子化分析物的离子源，一个用于测量离子化分析物的质荷比（m / z）的质量分析仪以及一个对每个m / z离子数进行计数的检测器。蛋白质挥发和离子化的两种最常用技术是：（1）电喷雾电离（ESI），它使液体样品中的分析物离子化；（2）基质辅助激光电离（MALDI），它使干基体中的分析物离子化，前者更常用于复杂样品。这种直接的技术可以实现高特异性，但灵敏度较低，需要大型实验室设备并且操作昂贵，因此对于POC环境不理想[ 18]。然而，一些最近所描述的手持式质谱单位已报道，通过使用无线遥控器的自主操作或证明有相似的分析性能大规模质谱仪，但不需要任何的实验装置[ 69，70 ] 。这些现场部署的质谱仪具有在检测爆炸物和铀的应用（例如，下面的核事故）以及复杂生物样品[在化合物的分析69，71，72 ]，但尚未被应用到检测的大肽和蛋白质[ 73 ]。下图展示了质谱的工作原理（图1）。
PhilippeHupé/ CC-BY-SA-3.0许可的质谱协议[ 74 ]。
3.1。蛋白质复合检测的常规光学检测方法
3.1.1。表面等离子体共振（SPR）
有许多技术涉及使用无标签格式测量分子相互作用，包括石英晶体微天平，BioLayer干涉测量法和共振波导光栅，但是SPR是领先的技术[ 18 ]。SPR是一种测量特定分子相互作用的技术，例如蛋白质与抗体的结合，其中溶液中的分析物与结合到传感器表面的分子（例如，通过羧甲基化的葡聚糖聚合物）相互作用（通常由金膜组成）在玻璃表面上[ 75]。传感器表面的金面与流道接触，而传感器表面的玻璃面位于棱镜上。在全内反射下，光将光子转换为包含在金层中的表面等离激元。光必须以特定的入射角入射到表面，该入射角取决于靠近金表面的折射率，才能被反射和减小，从而产生特征性的表面等离子体共振（SP）波段。当分析物结合到表面上时，质量浓度的变化会导致折射率发生变化，进而使SP谱带和检测器吸收的光量发生变化。监视入射角，以便实时检测结合事件。尽管此技术的优点是无标签且相对敏感，76 ]。但是，无标记生物传感的最新进展以及光纤或波导的使用表明，现场SPR传感可能即将到来。一些例子包括紧凑SPR的发展传感器，其能够在等离子体分析在水中，并组合SPR成像传感器和蛋白质阵列，用于检测蛋白质的的创作化学污染物的[ 77，78 ]。其他SPR装置已被开发为快速检测DNA和蛋白质在微升体积，表明小型化的SPR装置可以在将来[开发79，80 ]。图2演示了SPR的工作方式。
表面等离子体共振（SPR）[ 81 ]，已获得Sara Sabban / CC-BY-SA-3.0的许可。
3.1.2。流式细胞仪
流式细胞术是一种测量生物标记的珠子在流过检测器时一次测量一次的技术[ 82 ]。通过更改使用的内部标记（不同的染料）或珠子的大小，这些珠子可用于多路复用。流式细胞术允许将与颗粒相关的荧光分子与游离荧光分子区分开。被用在多种临床应用，从测量细胞DNA含量，以确定疾病特异性细胞类型用于诊断和预后目的[本技术42，83]。流式细胞仪还用于进行免疫分析，在检测各种生物标志物方面具有广泛的潜力。有许多商品化的产品能够通过对颗粒进行顺序分析来以多重方式进行基于珠子的流式细胞术（例如Luminex产品）。珠子已被证明是用于分选细胞，蛋白质或其他大小不同的颗粒的一种手段[ 42 ]。具有特定荧光强度的标准珠可用于建立质量控制-随时间推移采集的样品数据以及不同实验之间的数据均可归一化。尽管流式细胞仪可用于诊断目的，但仍希望将此技术与DNA分析或其他程序结合起来以提高流式细胞仪的价值[ 83]。然而，尽管典型的商业仪器的尺寸可能会限制流式细胞仪在POC环境中的应用，但该技术的一些优势包括其速度，准确性，低背景信号，可再现性，成本效益和灵敏度[ 54 ]。但是，已经开发了包含小型光学组件并采用微流技术的微流式细胞仪，并且便携式[ 84 ]。微流式血细胞计数器已应用于许多领域，如临床样品[在海洋藻类的表征和检测细菌和毒素的85，86 ]。片上实验室流式细胞仪也在开发中，但目前尚无商业购买[ 45，46 ]。
3.1.3。酶联免疫吸附测定（ELISA）
定量生物分子的最常用和最有效的方法是ELISA（图3）[ 11 ]。该方法能够通过使用可探测不同蛋白质的空间不同的孔进行多路复用。ELISA通常使用比色法或发光法进行检测，并使有色反应的产物吸收或产生可检测范围内的光[ 87 ]。在比色ELISA中，产品的光密度与所测分析物的数量成正比。这些测定通常使用96孔微量滴定板进行。类似的方法的ELISA是中尺度®™系统，它使用电化学发光方法进行多路复用。Meso Scale不仅可以探测单个板上的几个不同孔，还可以探测单个孔内的不同分析物。
使用辣根过氧化物酶（HRP）的ELISA检测方案。
ELISA在性能方面有一些缺点。当Coenen 等。，评估了六种不同的ELISA来检测相同的目标抗体，检测抗体的性能临界值，再现性，敏感性，特异性和准确性差异很大，这表明制造商的诊断测试需要标准化[ 88 ]。具体来说，由于类似测定之间的差异，需要对试剂，分析，数据存储和标准化技术进行标准化[ 25 ]。
涉及POC要求时，ELISA的适用性也很有限。从ELISA获得数据通常需要专门的实验室和昂贵且笨重的酶标仪。然而，萨普斯福德等。，证明了比色SEB ELISA的小型化，将样品量减少至<5μL/孔[ 44 ]。还有一些方法可以减少用户与实验的交互，例如使用顺序注射分析技术，该技术可以通过使用注射泵和切换阀[ 89 ] 自动清洗和添加试剂溶液。最近，引入了一种称为数字ELISA的新技术，可以检测到亚飞摩尔浓度的蛋白质[ 18]。在这种单分子免疫测定中，将酶溶液与样品，捕获珠和检测抗体一起捕获在含有荧光底物的50飞升孔中，并密封。与标准的96孔实验一样，数字ELISA避免了对扩散的依赖。尽管该技术仍处于起步阶段，但数字ELISA对于需要单分子敏感性的自动化，高通量应用非常有前途。尽管ELISA也容易产生基质效应，但酶的扩增通常比荧光夹心免疫测定法灵敏，后者缺少扩增步骤[ 90 ]。
3.1.4。荧光免疫分析
ELISA与荧光免疫测定相似，因为它们通常以夹心形式进行（两种抗体特异性结合同一靶标上的不同表位）[ 91 ]。然而，ELISA中使用的酶，如辣根过氧化物酶（HRP），加上对信号产生的比色或化学发光底物，而不是荧光标记[ 92，93 ]。在荧光免疫测定中，相对荧光单位（发射的光子数）与存在的分析物的数量成正比[ 87]。荧光免疫测定法可能不需要使用生物素-链霉亲和素相互作用，而是将染料标记的抗体暴露于目标蛋白以进行检测，从而减少了执行测定所需的时间。
荧光检测标签
多种荧光标记可用于荧光免疫测定。有机荧光团（其可以重新发射的光激发以下荧光化合物），例如二聚花青染料，Cy3和Cy5在文献中通常用于定量蛋白质[ 94，95 ]。两种染料都经常使用，因为它们的亮度高，非特异性染料之间的相互作用低，并且由于它们在市场上可买到，具有广泛的反应性化学物质，可促进标记，例如标记蛋白质赖氨酸残基的能力[ 54 ]。尽管荧光染料是经常使用的，但它们具有诸如光稳定性和亮度低以及固有的背景荧光之类的局限性[ 96 ]。
使用量子点（QD）可以实现将空间和频谱多路复用相结合的一种多路复用方法（图4）。由于多个QD具有较宽的吸收带宽并可以在一个特定的波长激发，因此该技术可以提高免疫测定的复用能力，但它们各自在可见光范围内具有较窄的光谱带宽。因此，可以将来自每个QD的信号彼此区分开。
CdSe / ZnS量子点的性质。（A）光致发光光谱；（B）UV激发后的量子点改编自[ 19 ]。版权所有（2011）美国化学会。
使用96孔微量滴定板进行的实验成功解卷了来自对应于三种目标分析物的三种不同QD的信号[ 19 ]。这些成就表明，例如，一个96孔板可以产生96个以上的数据点，因为每个孔可以检测到多个目标分析物。只要使用三种以上的量子点，只要它们的发射波长在光谱上是不同的，就有望扩展这些研究以区分更多的分析物。QD可应用于平面和悬浮生物芯片，可用于检测单个分子，并可用于荧光共振能量转移（FRET）中以增加特异性和POC用途[ 96 ]。
量子点的一些缺点是与其他荧光标记物相比，其成本增加，毒性和大小[ 97 ]。避免与购买QD相关的费用的一种方法是在内部合成它们[ 98 ]。由于量子点通常由重金属如镉或铅，其是高毒性的材料，当应用于它们可能对关注的体内应用[ 97，99 ]。最后，量子点的大小通常要比有机荧光团大，这可能会破坏生物传感平台中涉及的蛋白质的自然结合动力学，因此涉及量子点的分析必须谨慎优化。
3.2。小型化检测
除了使用小样本量的临床相关性（在第2.1节中讨论）外，使用小样本量还具有其他优势，例如简化平台格式，提高灵敏度，增加吞吐量和随后的数据量[ 19 ] 。例如，一些微流体异质免疫测定已显示可检测到飞摩尔范围内的LOD的细菌毒素[ 100 ]。据报道，一种用于检测与自身免疫疾病相关的自身抗体的小型免疫测定的LOD达到了经典ELISA的LOD的1/50，并且所需体积减少了100倍[ 101 ]。其他涉及自身抗体阵列的研究表明，其灵敏度是ELISA的4至8倍，并且在1000倍范围内呈线性关系[25 ]。这些实验使用自动阵列仪将抗原点在表面上，并用单克隆抗体或血清样品进行探测。
为疾病的分析中的用途蛋白质阵列技术的，而不是一个新概念，是一种新兴的功能强大的技术用于剖析蛋白质水平，并因此识别生物标志物指示疾病[ 5，35，36，102 ]。尽管存在许多改良的ELISA作为商业抗体测定法，但该试剂盒通常需要许多清洗步骤，会产生大量废物，价格昂贵，并且过程冗长[ 103]]。尽管存在这些挑战，但仍存在与微阵列使用有关的问题，例如与打印和检测，数据标准化，实验和实验室之间缺乏参考样品有关的技术问题，以及测量在实验室中存在的样品中生物标志物的能力。如此变化的浓度[ 104 ]。
先前已经开发了用于蛋白质多重检测的显微镜载玻片阵列，但是执行化验所需的体积通常约为50μL[ 76 ]。研究小组开发了多种蛋白质检测平台，并且有一些采用平面波导技术的商业化生物传感器，但仍有潜力减少进行这些测定所需的体积[ 105 – 112 ]。
3.2.1。蛋白质微阵列
蛋白质微阵列比传统的ELISA和荧光免疫测定法（在96孔板中执行）具有许多优势，因为它们有助于使用相对少量的样品来确定与大量靶标的抗体反应性，并且在某些情况下，据报道可以达到更好的效果灵敏度[ 113，114 ]。它们已用于确定疫苗接种反应，筛选与疾病相关的生物标记以及评估抗体的特异性。但是，与DNA阵列相比，蛋白质阵列不那么精确或可重复[ 17 ]。许多研究小组已将抗体微阵列用于生物标志物的多路复用，并将其结果与标准ELISA进行了比较[ 97]。尽管许多期刊文章都谈到了将其平台开发为POC系统的潜力，但所报道的系统很少是实际的独立生物传感器。
多种不同类型的技术可以应用于蛋白质微阵列。图1显示蛋白质可以多种方式附着到表面，例如非共价或共价附着[ 115]。可以将不同类型的分子固定在表面上，包括抗体，肽或纯化的蛋白质。用于检测蛋白质的免疫测定策略主要有三种类型：三明治，抗原捕获和直接。有许多技术可以与适当的缓冲液结合使用，以使固定的蛋白质保持其最活跃的状态。该图还显示了各种检测方法，其中一些方法比其他方法更好，可用于检测小样品量内的低浓度蛋白质。检测方法很重要，因为没有蛋白质扩增程序[ 115]。ELISA可以通过使用酶来放大检测信号，但这不会扩增蛋白质本身。基于特定的应用和所需的分析类型，阵列技术，固定技术，捕获分子和检测技术（图5）的某些组合可能比其他方法更适合。结合适当的微阵列技术，可以设计比ELISA更好的平台。
蛋白质微阵列的不同技术。
蛋白质微阵列分为两大类：平面表面测定或珠/悬浮液测定[ 49 ]。前者可以在玻璃，硅或硝酸纤维素上进行，并利用固相动力学。后者使用微米大小的珠子，可以通过使用诸如Luminex的仪器通过色码，形状或大小来区分。珠分析使用液相动力学，与使用平面表面分析相比，可以更快地进行检测。
在平面阵列中，定量蛋白质微阵列有两种主要类型：正向和反向阵列[ 17 ]。正向蛋白质阵列涉及将抗体固定在表面上，并评估与固定抗体结合的样品中的蛋白质水平。另一方面，反相蛋白质阵列绕过了对捕获抗体的需求，因为临床样品的提取物被印在表面上，然后再用蛋白质或抗体进行探测[ 116 ]。这些类型的测定法常用于评估磷酸化状态[ 17]。与正相分析相比，反相分析具有相对较低的灵敏度，因为当蛋白质以低浓度存在时，与其他表面相比，与表面结合的目标蛋白质更少，因此一级抗体具有较少的可用结合位点。但是，反相分析仅受高亲和力抗体的限制[ 116 ]。由于反相形式依赖于一种抗体，因此对于这种类型的测定法，必须进行广泛的验证。反相分析常用于自身抗体谱分析[ 21 ]。
一些多重蛋白微阵列需要对信号进行定量，而对于其他应用，定性反应就足够了。例如，Rowe-Taitt 等。证明了使用一种需要荧光检测的检测方法来检测六种不同的生物危害因子。成像后，可以用眼睛解释结果以确定是否存在分析物（即，检测特定分析物的检测点是否亮或钝）[ 117 ]。在这种情况下，仅知道是否存在药剂就足够了，并且药剂的浓度并不重要。
已经开发了一些商业蛋白质微阵列，例如使用Luminex的xMAP技术的AtheNA Multi-Lyte测试系统和BioPlex 2200 ANA筛查[ 49 ]。这些免疫测定法可以筛选与风湿性疾病有关的多种自身抗体。CombiChip自身免疫是另一种可商购的产品，可用于帮助鉴定自身免疫疾病。该产品使用硝化纤维涂层的载玻片，需要手动成像和分析。Meso Scale Diagnostics采用电化学发光方法，可用于定量细胞因子，趋化因子，磷蛋白和毒理学生物标志物等。
生物分子固定化
如上所述，有多种将生物分子固定在不同表面上的方法。分子可以变得固定在两个主要方面：通过物理吸附或通过共价键[ 118，119 ]。一种固定的常用方法是通过非特异性物理吸收。但是，该技术不如采用共价结合有效和可重复[ 17]。共价结合是有利的，因为仅某些反应性基团参与形成键。氨基酸赖氨酸和精氨酸上的伯胺由于基本上存在于所有蛋白质上而常被用作结合的反应基团。最常用的胺反应化学是N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。1-乙基-3-（3-二甲基-氨基丙基）碳二亚胺（EDC）也经常使用，因为它与表面上存在的羧基反应。但是，这种方法容易出现诸如在水性环境中EDC水解，易发生交联以及需要超过1000倍过量试剂的问题，这可能会导致混合亲和力和异构结构[ 19]]。材料如塑料或硅，以及滑动涂覆有硝酸纤维素的聚合物，例如，FAST载玻片[ 20，21，101，104 ]可以代替先前描述的化学物质的使用。硅表面也有希望的[ 120，121 ]和物理化学上可以进行修改，以结合蛋白与媲美FAST载玻片[亲和122 ]。此外，还有许多不同的商用载玻片表面，专门设计用于机器人微阵列分析仪[ 20 ]。可以使用PDMS流通池，模版或通过机器人机器进行印刷来将抗体构图在表面上[ 123 ]。
微阵列的缺点
开发用于生物标志物筛选的多重平台时，存在许多关注的领域，其中主要涉及重现性（幻灯片间和幻灯片内变异）和样品归一化。为了解决一些与蛋白质芯片相关的问题20，21，40 ]，各种控制可以被实现为允许微阵列如重复点，阴性对照斑点，对于方位标记斑点，斑点的广阔的市场应用测试捕获和检测抗体的交叉反应性[ 49 ]。
可能影响微阵列实用性的其他因素包括多克隆或单克隆抗体的使用。选择最合适的抗体进行实验非常重要，因为亲和力和特异性会受到影响。另外，必须严格控制发生抗体构图的条件，例如温度和湿度。最后，图案化后用封闭缓冲液/试剂（例如PBS + 1％牛血清白蛋白）封闭表面对于防止蛋白质的非特异性吸附至关重要。
除了测定的可变性外，某些微阵列的线性动态范围也不理想[ 113]]。当前用于分析数据的方法通常依赖于信号强度的直接比较，这限制了抗体和荧光信号之间的定量。与可利用独立标准曲线的ELISA相反，微阵列没有用于检测与不同靶标结合的抗体的通用标准。由于抗体对其靶标的亲和力可以在生物基质中变化，因此需要一些方法来量化微阵列中独立的抗体浓度。开发了非线性校准以量化抗体与表面结合的数量。该方法将一系列已知量的抗体（来自相同物种）添加到阵列上。IgG用于创建非线性标准曲线，
除了与传导蛋白质微阵列固有相关的缺陷外，常用的用于量化结果的微阵列扫描仪也有缺陷。例如，使用GenePix 4000B微阵列扫描仪进行分析是有问题的，因为用于激发的激光被限制在绿色或红色范围内，而蓝色范围对于分析使用QD的微阵列是首选。激光功率设置仅限于100％，33％或10％。另一个缺点是，由于微阵列扫描仪仅针对Cy3和Cy5进行了优化，因此无法使用所使用的每种标记物来配置滤光片发射。像酶标仪一样，微阵列扫描仪并未针对POC进行优化。提到的微阵列扫描仪的尺寸为34.29厘米×20.32厘米×44.45厘米，重量为25磅。费用> $ 50,000。结果，专门设计用于某种荧光标记的数据检测平台的开发变得越来越流行。研究人员可以设计平台，这些平台配置为使用适当的激光器和滤光片来管理最适当的激发波长并捕获最佳发射波长范围。但是，这样做可能会将应用程序限制为一组特定的荧光团。
3.2.2。芯片实验室设备
芯片实验室设备将诸如采样，样品预处理，分离，检测和数据分析等处理步骤集成到一台用于POC感测的小型机器中。理想情况下，片上实验室设备应满足多种规格。首先，必须将设备的光学，电子和流体组件合并到单独的隔室中，以使光学和电子设备的功能不会因暴露于流体而受到损害[ 124]。]。其次，光学组件应以易于更换零件的方式并入设备中。第三，根据大规模生产的需要，用于流体的储器应适合于注射成型。第四，必须将样品和示踪剂分子的储存室分隔开，以免它们混合。微流体系统是在诸如硅，玻璃或聚合物衬底等材料上制造的毛细管网络（深度通常为10–50μm，宽度为10–400μm）[ 48 ]。流体的流动通常通过电渗作用来控制，例如施加电场或真空。微流体技术可以将样品处理步骤并行化和集成到一个小型设备上[ 125]。其他好处包括小型化，自动化和一次性设备的一次性装置。
微流体系统已用于蛋白质分离，激酶反应和免疫测定[ 48 ]。使用玻璃或聚苯乙烯珠固定并夹有含有目标分析物的样品的玻璃或聚苯乙烯珠在微流体系统中已证明需要添加分析物，然后添加标记抗体的夹心测定形式。在一个实例中，当使用注射泵控制流量时，对于容纳在50 mm×70 mm空间中的四个反应室，反应时间为30分钟。在另一个例子中，开发了“滑动芯片”以使用磁珠进行免疫测定[ 126 ]。这种方法涉及两个带有不同入口，出口和孔的微型玻璃载玻片，样品在其中暴露于所需的试剂中。
不幸的是，微流控系统已经很少从学术界的概念证明发展为商品化产品[ 125 ]。但是，有一些无标记的微流体系统可商购，例如Triage系统和VIDAS平台，它们使用荧光技术对与心脏病相关的蛋白质进行多重检测[ 49 ]。微流控芯片的图像如图6所示。
由玻璃制成的芯片实验室[ 127 ]许可©Micronit / Wikimedia Commons / CC-BY-SA-3.0。
3.2.3。光纤方法
许多研究小组已经开发了用于生物传感的光纤方法[ 105 – 112 ]。例如，使用便携式光纤荧光分析仪确定动物肾脏的肾小球滤过率[ 128 ]。金等。已开发出一种称为RAPTOR的设备，一种便携式光学荧光计，它使用多个单光纤探针以快速，自动化的方式检测多种分析物（每个靶标一个探针）[ 51]。RAPTOR已被证明可以在10分钟内荧光检测孢子和卵清蛋白以及其他细菌，病毒和蛋白质分析物，没有任何假阳性，也没有任何样品处理（样品可以手动添加或通过计算机控制的空气采样器添加） [ 124 ]。作者还展示了经过几次洗涤循环后，该装置可以以相同的功效重复使用的能力。该设备对以前的光学生物传感器（例如Analyte 2000）进行了改进，该传感器将单个光纤探针串联连接以执行多重免疫测定[ 103 ]和RAPTOR的前身MANTIS [ 51]。]。所述RAPTOR可以其中的所有过程，包括数据分析，是自动的[在一个场展开格式波导的表面上进行4次夹心免疫51，124 ]。尽管具有优点，但RAPTOR仍存在一些缺点，例如尺寸（18.6 cm×27.4 cm×17.3 cm）和重量（0.91 kg），两者均大于便携式POC设备的理想规格[ 51 ]。 。此外，RAPTOR利用独立的光纤波导来检测每种分析物，因此必须一次分析一种样品，并且使用其四个不同的通道只能检测到四种分析物[ 124]。]。Research International出售的下一代RAPTOR和BioHawk可以同时检测多达8种分析物，但每个样品都必须单独检测[ 129 ]。BioHawk设计可以识别多达8种分析物并同时评估各种样品[ 56 ]。
3.3。当前的POC传感器
虽然学术界和工业界的许多科学家正在研究和开发新的POC测试，但仍有一些公司将其产品商业化。Nova Biomedical是一家在市场上拥有从手持式设备到临床分析仪以及自检设备的多种产品的公司[ 130 ]。例如，该公司的产品可测量葡萄糖，乳酸盐和肌酐。葡萄糖条成功地去除的血细胞比容和其它干扰并在几个同行评审出版物[已精选131 - 133 ]。
雅培（Abbot Laboratories）有一套称为i-STAT的POC设备，这些设备是手持设备，可以使用一次性药筒[ 134 ] 检测患者样品中的几种生物标记。该公司出售几种可用于诊断测试的生物标志物板，例如心脏板，凝血板，包括许多血气的板，血液学板和基本代谢板，包括电解质，葡萄糖和肾脏生物标志物肌酐和血尿素氮。
SenGenix是另一家正在开发一种新的荧光方法来测量生物标记物，称为荧光响应传感器，该方法绕过了芯片实验室技术和三明治测定法的需求[ 135 ]。取而代之的是，这家公司正在设计与荧光分子结合的捕获蛋白，只需要一个光源就可以激发荧光分子，然后用相机对结果成像。
《自然》杂志，特别是有关片上实验室技术的见解增刊[ 136 ]着重介绍了有关片上实验室技术及其在多路POC医学诊断中的应用的一些进展，例如Yager 等。，讨论使用微流体技术促进全球健康，并注意为发展中国家而设计的成功POC测试必须针对高温而设计，并且可能无法依靠制冷，试剂，电源或训练有素的操作员[ 137 ]。考虑到针对全球公共卫生需求的POC测试要求，一些研究小组正在研究使用纸质分析设备[ 138 – 140]。商业化的纸质POC设备可能会在不久的将来开发。
4.实际适用性
本文的主要主题是光学传感器平台在研究临床应用中的复用能力方面的应用。事实证明，POC测试不仅可以减少医生做出有关患者管理的决定所花费的时间，而且还有助于患者受益[ 141 ]。对于患者分类，例如在紧急情况，灾难或其他公共卫生危机之后，按需要正确执行测试对于患者分流也很重要[ 142]]。为了证明POC传感器与医学领域的相关性，我们在以下三种情况下描述了手持设备平台可用于满足实际公共卫生需求的情况。目前，尚无或具有良好性能的商品化产品可用于这些适应症的多方面研究：（1）测量性传播感染（STI）（2）测量与急性肾损伤（AKI）相关的肾损伤生物标志物和（3）测量心脏生物标志物，对心肌梗死的诊断和治疗很重要[ 143 ]。为了成功地将POC设备用于这些指示，它们必须是特定的，敏感的，易于使用的，可靠的，能够多路复用的，具有合理的成本以及较短的周转时间[ 144 ]。
4.1。性传播疾病（STIs）
由于临床上的即时诊断可以促进治疗和咨询，并减少进一步的传播[ 24 ] ，因此需要POC测试来诊断STI 。由于超过一半的性活跃者在其一生中都会接触某种类型的性传播疾病，并且由于许多性传播疾病都可以治疗，因此开发可在医生办公室使用的POC测试将是有益的。即使存在针对性传播感染的快速POC测试，但根据临床医生的要求，它们仍不够准确，难以阅读或过于昂贵。典型的STI测试包括湿式安装测试，尿液试纸，快速HIV测试以及通常的周转时间，结果需要2到14天才能提供给医疗保健提供者和患者[ 7]。因此，由于当前的测试没有价值，因此对于工业界来说，创建满足最终用户要求的新测试至关重要。与业界的看法相比，临床医生引用了当前测试的不同限制。为了创建针对性传播感染的有用的POC测试，行业需要更加关注临床医生的需求。例如，根据临床医生，由制造商设置的设备的成本是比执行测试所获得的报销金额更重要的因素。此外，测试所需的工作流程和时间中断是临床医生认为比行业推测更为重要的问题。新测试需要更加灵敏，特异性好，成本合理，周转时间短（5-20分钟），无创且易于使用和阅读[7，24 ]。在家里而不是在诊所进行测试会遇到障碍，因为某些患者可能不信任在家进行的测试，并且在遵循说明时可能会遇到麻烦，特别是如果说明仅以英语提供。淋病和衣原体似乎是STI POC测试开发的两个优先领域，其次是单纯疱疹病毒和血清转化为HIV [ 7，24，145。第一家制造多重POC装置的公司，以类似于家用妊娠试验的格式来探测最少量的性传播感染（通常被称为模型原型），肯定会对公众健康产生重大影响。
4.2。急性肾损伤生物标志物
测量相对较新的生物标记物，例如肾脏损伤标记物1（KIM-1）和中性粒细胞明胶酶相关的脂蛋白（NGAL），可以通过正确，快速地诊断患者（比现有方法允许的时间更早）来改善个性化药物，从而可以根据以下情况进行治疗患者的特殊需要[ 146 – 148 ]。目前诊断AKI的测试包括测量血尿素氮（BUN）和血清肌酐，但是这些生物标记物通常要等到50％的肾功能消失后才会升高，这显然不足以减少或预防AKI [ 149]。在许多相关情况下，使用少量样本在POC上诊断AKI很重要。例如，POC装置可在生物攻击，其中革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）可引发先天免疫应答[的场景中使用35，102 ]。暴露于LPS（内毒素）会导致全身血管舒张，减少肾脏灌注和随后的AKI [ 102 ]。此外，暴露于毒素后产生的炎症和细胞因子释放可能会引起肾毒性作用，导致NGAL和KIM-1水平升高，这可能表明早期肾脏损害[ 35]。在另一个例子中，POC设备在发展中国家是有用的，其中AKI是主要的医学并发症，特别是在败血症，腹泻病和传染病方面。在这种环境下，需要进行资源贫乏的医学检查。POC设备可用于AKI诊断的第三种情况是在碰撞伤害和自然灾害（例如地震）之后，这可能会对肾脏造成不利影响。最后，对AKI的快速诊断很重要，因为早期诊断可导致快速采取治疗，可能会给患者带来更有利的结果。在这些示例中，快速测试和治疗患者至关重要，通过使用能够复用和使用小样本的POC设备，可以使用最少的资源为大量人群提供护理。
4.3。心脏生物标志物
尽管许多疾病非常复杂，以至于检查多个生物标志物要优于检查单个蛋白质，但在一项评估使用三种心肌生物标志物（心肌肌钙蛋白（c Tnl），肌酐激酶同工酶MB（CK-MB）和肌红蛋白）的研究中，发现在POC测试中单独使用c Tnl足以诊断胸痛并预防心肌梗塞[ 150 ]。在POC测试使用心脏肌钙蛋白具有如此高的诊断准确率（100％灵敏度和几乎100％的特异性），其评估所述其他两种生物标志物可能不能提供额外的信息，特别是对肾功能不全患者[ 151，152]。实际上，c Tnl是一种很强的生物标志物，可帮助诊断和治疗心肌梗塞，以至目前的医学指南规定，c TNL的结果必须在抽取患者血液后60分钟内提供给临床医生[ 143 ]。但是，使用这三种生物标志物可能有助于识别可能在2小时内出院的急性冠状动脉综合征患者[ 153 ]，而使用CK-MB可能有助于诊断和治疗心肌梗塞[ 154]]。由于心肌梗塞和其他心脏病的早期诊断可能会对患者的预后产生重大影响，因此采用仅包含c Tnl或c Tnl以及肌红蛋白和CK-MG的POC传感器在采用不同情况时非常有用由世界各地的医院常规使用。
5.结论与展望
长期以来，一直使用来自ELISA和流式细胞术的各种光学传感方法来测量蛋白质以用于临床目的。但是，手持式，可现场部署的POC生物传感器预计将通过允许以多重方式更快地检测蛋白质而彻底改变患者护理。这些分析工具可用于检测蛋白质分析物，这些蛋白质分析物对诊断肾脏和心脏疾病至关重要。随着蛋白质组学，微流体学和纳米技术领域的发展，测定形式将变得更加简单易用。POC设备可满足各种临床需求，例如诊断疾病，确定预后以及选择最佳治疗方法。
致谢
作者要感谢Marilyn Lightfoote（FDA / CDRH / OSEL / DB）对这项工作的支持。
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提及商业产品，其来源或将其与本文报道的材料结合使用时，不得解释为卫生和公共服务部对此类产品的实际或默示认可。本文中的发现和结论不应解释为代表任何机构的决定或政策。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
