POCT传染病

传染病的即时检验：过去，现在和将来

托马斯R. Kozel，阿曼达R.伯纳姆Marusich

科琳·苏珊· 卡夫（ Colleen Suzanne Kraft），编辑

DOI：  10.1128 / JCM.00476-17

抽象

即时医疗点（POC）诊断可在遇到医疗保健系统的时间和地点为患者提供快速可行的信息。常用的平台是侧流免疫测定。最近，新兴的分子诊断技术已经满足了对POC应用的速度，低成本和易用性的要求。POC发展的主要驱动力是在基础设施有限的站点诊断传染病的能力。在富裕和资源有限的环境中的潜在用途已经推动了极大的努力，以建立在现有技术的基础上，并开发出用于诊断各种传染病的新技术。

介绍

在患者最初遇到卫生保健系统的地点或其附近进行现场护理（POC）测试，具有快速的周转时间（大约15分钟），并提供可导致患者改变的可行信息。管理。快速的结果减少了多次就诊的需要，能够及时进行治疗，并有助于控制传染病的爆发。POC诊断程序还减少了对推定性治疗的依赖，从而促进了抗生素管理。快速诊断测试通过检测在临床样品中发现或从中提取的分析物来工作。分析物有两种主要类型：微生物抗原和对微生物抗原具有特异性的患者抗体。但是，新兴的分子技术可以在POC上实现基于核酸的方法。

过去

最早在1917年Dochez和Avery的报告中首次将免疫测定法大量用于诊断传染病，可以通过对大叶性肺炎患者进行血清和尿液免疫测定来检测肺炎球菌多糖（1）。在有先见之明的评论中，作者建议抗原检测可以快速诊断感染。在免疫测定中的抗原或抗体为疾病的诊断的兴趣与由放射免疫测定（RIA）于1960年（所提供的高灵敏度加速2），并在1971年的酶联免疫测定（ELISA）（3，4）。实际上，在非POC中心实验室环境中，ELISA仍然是主要的免疫测定平台技术。此外，借助自动化技术，ELISA技术还可以实现高通量样品处理。但是，ELISA和RIA平台也很耗时，具有中等或高度的复杂性，需要训练有素的实验室人员，并且通常设备密集。因此，这些技术不适合POC使用。

诸如ELISA和RIA之类的免疫检测方法有望用于诊断疾病，这促使许多个人和生物技术公司找到在POC进行快速检测的方法。早期步骤包括使用醋酸纤维素片中的毛细管迁移作为免疫测定的结构基础（5）以及将抗体与胶体金或乳胶颗粒偶联的能力（6）。然后，几家公司开发了导致当前侧流免疫测定（LFIA）平台的技术（7 – 9）。使用侧向流形式的家庭妊娠试验提供了在家中使用抗原试验的形式价值的明确证据。反过来，诊断链球菌性咽炎的快速测试普及了LFIA技术来诊断传染病。

当下

大多数POC快速诊断程序都使用LFIA平台。LFIA平台非常灵活。高分子量抗原的检测需要一个抗体对，其中针对一个分析物抗原决定簇的抗体用报告子标记，例如胶体金，并且针对同一分析物的第二个抗原决定簇的捕获抗体被固定在侧流条上。在抗原捕获夹心格式中，测试线上的信号强度与分析物的浓度成正比。夹心免疫测定是对传染病进行POC检测的基础，可检测临床样品中的微生物产物，例如A组链球菌细胞壁碳水化合物（表1））。用单个抗原决定簇检测低分子量分析物需要竞争性形式。在这些测定中，测试线的强度与分析物浓度成反比。使用竞争形式的测定的例子包括许多用于检测滥用药物的免疫测定。最后，LFIA格式可用于检测针对靶抗原的患者抗体。在这种情况下，将靶抗原固定在试纸上，并通过使用标记的报道分子（例如第二抗体）来检测患者抗体的结合。LFIA格式的血清学检测方法包括HIV-1 / 2或丙型肝炎病毒检测（表1）。

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表格1

豁免CLIA的传染病检测示例a

许多测试已获得可用于POC的临床实验室改进修正案（CLIA）豁免（表1）（10）。免于CLIA的测试通常很简单，并且错误结果的风险很小。相比之下，FDA归类为具有中度或高度复杂性的测试通常在中央实验室进行。分类标准包括执行测试所需的知识，所需的培训和经验，试剂准备的需求，操作步骤的数量和复杂性，校准和质量控制的程度，设备维护以及需要独立解释的需求与判断（11）。毫不奇怪，在POC中使用LFIA技术的能力在资源有限的国家中发挥着重要作用。另外，已经开发了利用分子方法的有限数量的POC测试。下面介绍了几种POC测试，这些测试说明了当前的应用范围。

战略性筛查-CrAg LFIA用于隐球菌性脑膜炎。用于检测隐球菌多糖（隐球菌抗原[CrAg]）的乳胶凝集测定法是诊断传染病的首批免疫测定法之一（12）。最近，开发了一种LFIA，并已通过FDA批准作为处方使用的实验室测定法，用于检测血清中的CrAg（13）。尽管CrAg LFA在发达国家是基于实验室的测定法，但世界卫生组织（WHO）最近的一份报告指出，成本低，结果快，缺乏所需的基础设施以及由很少人员进行的能力培训满足世界卫生组织最一 ffordable，s ^ ensitive，小号pecific，ü SER喜欢的，- [R APID /健壮，ê -自由quipment和d为POC测试eliverable给最终用户（ASSURED）标准（14）。为此，威廉姆斯等。最近报道，在资源有限的情况下，用指尖全血进行CrAg侧向血流分析（LFA）测试可以通过测量打开压力来帮助优先进行诊断性腰穿的患者（15）。

对艾滋病患者进行CrAg检测的一个重要进展是发现，对血浆中的CrAg进行筛查以检测正在接受抗逆转录病毒治疗（ART）的患者的亚临床疾病，可以确定罹患隐球菌性脑膜炎的最高风险患者（16）。这一发现导致WHO建议在那些隐球菌抗原血症高发地区的CD4计数低于100细胞/ mm 3的患者中，在ART始发之前应考虑血清或血浆CrAg的筛查。阳性反应将触发先发性抗真菌治疗（14）。

易于收集样本-使用口服液检测HIV抗体。几项LFIA已获CLIA豁免，可用于检测指尖或静脉穿刺全血中的HIV抗体（表1）。此外，已经开发出用于HIV抗体的LFIA，可用于口腔标本，例如OraQuick Advance快速HIV-1 / 2抗体测试。该测试最初于2004年获得美国食品药品监督管理局的批准，可用于口服液，指状全血，静脉穿刺全血和血浆标本。该测试随后在2012年被批准为用于口腔液样本的非处方测试。由于样本采集的无创性，口服液可能更适合患者。对于不希望在公共卫生场所进行测试的个人，在家中使用还可以提供一种选择。最后，口服液的评估可减少医护人员的血液暴露。

尽管可以由非专业人士或家庭使用进行快速HIV检测的许多优点，但口服液的使用也受到限制。对测试诊断准确性的系统回顾和荟萃分析发现，对口腔标本使用OraQuick测试的合并敏感性比对指尖标本的测试敏感性低约2％（17）。使用Avioq HIV-1 Microelisa系统对尼日利亚纵向队列进行的研究发现，与在HIV感染后早期获得标本的血液检测相比，口服液检测对抗体检测的敏感性降低了（18）。Curlin等。还报告说，在某些情况下，口服液体OraQuick测试可能无法检测到HIV-1感染（19）。失败的原因是多方面的，其中包括与基于实验室的血液抗体检测和操作员熟练程度或变异性相比，缺乏敏感性。最后，当HIV-1传播的风险远高于确定的感染时（参见参考文献20），对HIV抗体的检测可能无法识别急性HIV-1早期感染。尽管HIV测试存在这些局限性，但OraQuick口腔样本或家庭妊娠测试或用于与尿液一起使用的滥用药物的测试证明了LFIA平台在替代样本类型用于家庭测试或用于资源有限的环境中的潜力。

诊断可及性-疟疾。大多数疟疾病例发生在医疗资源和基础设施有限的地区。因此，疟疾诊断人员影响公共卫生的能力在很大程度上取决于诊断人员的可及性（21）。此外，当在新的理论疟疾诊断方法对公共卫生影响的模型中对各个变量的影响进行排名时，发现诊断可及性比诊断敏感性或特异性对保存的总寿命而言是更具影响力的参数（22）。例如，据估计，具有90％敏感性和特异性的基于现场的POC疟疾诊断每年可挽救超过220万条经调整的生命，并防止4.5亿次不必要的治疗，但是具有95％敏感性和特异性的测试即使需要最少的实验室基础设施，也可以节省只有180万调整后的生活，仅防止4亿不必要的治疗（22）。因此，检测各种疟原虫的 LFIAsp。如今，蛋白质抗原已成为全球范围内最易获得，使用最广泛的疟疾实验室诊断方法之一。疟原虫抗原的快速测试在非POC实验室环境中也很有价值，因为它们易于使用并且能够提供全天候的一线分类结果。然后，可以在标准工作时间内通过专家显微镜确认阳性结果。

POC的高灵敏度-分子诊断。LFIA用于抗原检测的性能关键取决于临床样品中分析物的浓度。分析物浓度低于测试的检测限可能会产生假阴性结果。例如，疾病预防控制中心（CDC）最近对快速流感诊断测试与逆转录PCR（RT-PCR）或病毒培养相比灵敏度有限表示关注，并指出阴性快速测试结果应谨慎理解，尤其是当流感活动高时（23）。在另一个例子中，对于A组链球菌咽炎快速诊断试验的荟萃分析发现的大约86％（灵敏度24，25）。结果，对链球菌性咽炎的阴性快速检测结果是对儿童和青少年进行了培养（26）。

对某些抗原检测LFIA的临床敏感性低的担忧导致人们花费大量精力开发可以提供高敏感性和POC快速诊断的分子诊断。尽管POC分子诊断领域还很年轻，但是已经有一些符合POC使用标准的分子检测，例如快速检测和CLIA豁免。基于核酸扩增的第一测试被授予CLIA放弃是我了Alere流感A＆B试验，其被批准在2015年元月该测试使用等温DNA扩增技术的变化，被称为Ñ伊京Ë nzyme 一个 mplification ř eaction（NEAR），用于检测A和B型流感病毒的RNA基因靶标（27）。周转时间为15分钟，获准用于CLIA豁免的样品为鼻拭子。在一项七点临床研究中，与病毒细胞培养相比，A型流感的测定灵敏度和特异性分别为97.8％和85.6％，B型流感分别为91.8％和96.3％（27）。

自从批准Alere i甲型和乙型流感测试以来，CLIA已免除了其他几种分子测试，包括在Alere i平台上使用咽拭子对A组链球菌（GAS）进行的测试，可在大约8分钟内提供结果（28）以及在Cobas Liat平台（Roche Diagnostics）上进行的三项测试。Cobas Liat系统基于细菌DNA靶标的实时PCR检测或病毒RNA靶标的实时逆转录酶PCR检测。目前的Cobas LIAT系统上可用CLIA-放弃测试包括流感A / B，GAS，和流感A / B加呼吸道合胞病毒（RSV）（29，30）。对于批准的样品类型，包括鼻咽拭子（A / B流感和A / B流感加上RSV）和GAS的咽拭子，所有Cobas Liat平台测试的周转时间为15至20分钟。Cobas Liat和Alere i平台测试均以按需（即随机访问）格式运行。这两个平台都需要Alere i或Cobas Liat台式机器形式的专用设备来进行放大和分析。Cepheid的Xpert Flu / RSV Xpress测试也免于CLIA，但需要1小时进行样品制备和实时逆转录酶PCR。为了表明POC分子诊断领域处于发展曲线的早期以及快速增长还有多少潜力，只有两项CLIA豁免的分子GAS检测，但有79项CLIA豁免的GAS横向流动免疫测定（表1）。

未来

尽管POC测试现在已被广泛接受并且LFIA平台已经成熟，但是，即将出现的许多技术将改善可访问性，测试性能以及最终用户的采用率。下面描述了一些潜在的发展和驱动力。

微流体。微流体设备可以为样品处理，流体处理和信号生成提供完全集成的POC设备。一个主要目标是在远程设置中使用的低成本诊断程序。基于微流体的设备使用通道通过促动力来输送少量流体。片上免疫测定法与标准LFIA，ELISA或分子诊断平台有很多相似之处。但是，微流体技术的使用降低了测定的复杂性，并可以进行多重分析和高通量筛选。片上核酸分析特别有希望，因为它可以最小化和整合各种测定步骤，包括（i）裂解或提取靶细胞以产生其遗传成分，（ii）纯化核酸，（iii）扩增核酸

当前开发芯片实验室诊断的努力包括鉴定新的生物标记，以及集成的微流体设计，建筑材料和检测器技术。在这一点上，很难预测哪些技术将成为商业上可行的产品。特别需要关注的是每次测试的成本以及对驱动设备和产品检测所需的仪器的需求。一种新颖的分析方法是使用层状纸来构建三维微流控设备，该设备可以垂直和水平分布流体，并使流体流彼此交叉而无需混合（31）。关于检测器技术，最近描述了一种通用的移动式电化学检测器，其可以使用移动电话（32）将结果传送到远处。这些和类似的发展对于资源受限设置的芯片实验室诊断至关重要。

交流性。POC分析的近期目标是使用从测试中获得的信息来影响患者的护理。对于LFIA，通常可以通过目测获得结果。但是，对于许多疾病，特别是诸如流感或新发传染病之类的传染性疾病，POC分析的使用可以提供疾病监测的关键要素。通过全球定位系统（GPS）将数据链接到特定地理位置可以提供有关疾病出现，疾病传播或控制进展的信息。

典型横向流POC分析的结果传递需要具备数字捕获数据并将结果传递到中央数据库的能力。当前有许多电子阅读器。但是，一个特别吸引人的选择是修改智能手机，以在资源有限的环境中用作阅读器。如果对结果记录和报告进行标准化，则可以最好地实现疾病监测结果的有效沟通。理想情况下，可以将多种检测技术组合在一个仪器中。对于连接和商定标准的目标，存在三个主要警告。首先，阅读器技术增加了测试成本。这可能会使资源限制的设置无法进行此类高级结果处理。第二，使用电子阅读器扫描POC测试并存储或传输患者数据会引起对数据隐私和安全性的关注。最后，标准制定的时间至关重要。如果标准制定得太早，结果可能是较弱的技术的制度化和创新的窒息。

分子诊断。历史上，分子诊断的高灵敏度和特异性是以周转时间（小时），昂贵的设备投资以及需要用户培训为代价的。但是，等温DNA扩增的最新发展，例如Meridian Biosciences Illumigene或Quidel AmpliVue诊断平台，可用于检测单纯疱疹病毒，艰难梭菌，百日咳博德特氏菌，B 组链球菌等在简化分子诊断工作流程方面取得了长足的进步。例如，在一个有趣的转折中，AmpliVue平台使用由新分子和经典LFIA方法组成的混合策略，从而避免了对电子阅读器的需求。在这种策略中，在等温DNA扩增步骤中将两个标签（例如生物素和6-羧基荧光素[FAM]）掺入DNA扩增子，然后通过LFIA（例如抗FAM抗体）检测扩增的DNA的存在在测试线处，并用抗生蛋白链菌素缀合的有色颗粒作为检测器）（33）。尽管没有放弃POC或CLIA，但此类测试已使分子测试结果在2小时内可用，其中相对较大的时间可作为“走开”时间，从而使实验室技术人员腾出了其他精力。

但是，直到2015年，还没有任何CLIA豁免的分子诊断方法可以将高诊断灵敏度和分子检测的特异性带入POC。鉴于该领域尚未开发的大量商机，近期内可能会带来与现有CLIA豁免的分子平台（例如Alere i或Cobas Liat）相似的CLIA豁免POC分子诊断的快速扩展。更长远的未来可能会带来新颖的POC分子平台，使其与传统LFIA的可负担性和从样品到答案的用户简便性相匹配。

最终，即使在极其坚固，资源有限的现场环境中，将分子诊断带入POC也是可行的。高灵敏度分子诊断从参考实验室到现场的成功迁移，可以大大提高POC诊断相对于现有快速（即LFIA）测试的准确性和敏感性，增强公共卫生报告，并有助于在这些困难的环境中控制疫情。为此，最近在塞内加尔对疟疾分子诊断试剂（Illumigene疟疾LAMP）进行了现场测试（34）。该测定提供的结果在1小时内（包括样品制备）在或低于WHO推荐的2种寄生虫/μl阈值。在资源有限的环境中，该方法在POC现场使用的关键设计特征包括：环介导的等温扩增，无需热循环仪；冻干的试剂可在高温下长期保持稳定；相对简单的操作步骤，易于操作-由现场实验室的操作员使用。

最后，分子诊断的内在优势之一是它们的多重能力。可以区分多种病原体的分子诊断板已经用于中央实验室和参考实验室。放弃了CLIA并可以在≤15分钟内提供结果的新型分子面板诊断技术的开发，可以为POC带来大规模的复用。如何确定这种POC分子小组讨论会，最好纳入临床诊断算法和基于多重综合症测试方法的临床和经济利益将成为重要的问题（35，36）。

宿主生物标志物。检测微生物抗原作为特定病原体感染指示的一种替代方法是使用宿主生物标记物来区分感染微生物的种类，例如，将细菌与病毒感染区分开。此类测试在生物防御对策策略中以及在资源有限的国家/地区使用POC（例如，区分由疟疾引起的急性发热疾病和细菌感染）中均具有重要价值。Kapasi等。最近审查了59项研究，评估了112多种宿主生物标志物，以区分细菌与非细菌性急性发热疾病（37）。这篇综述鉴定了几种具有较高诊断性能的宿主生物标志物，包括肝素结合蛋白，C反应蛋白加干扰素γ诱导蛋白10以及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）和降钙素。这些宿主蛋白目前无法使用FDA批准的检测方法在POC上鉴定出来，但是向POC格式（如LFIA）的移植是完全可能的。在另一种检测宿主生物标志物的方法中，Herberg等人。通过微阵列检测RNA的表达以区分发热儿童的细菌感染和病毒感染（38）。结果确定了可以区分细菌与病毒感染的2转录RNA生物特征。这项研究有很多局限性，但结果令人鼓舞。如果针对微流体学的研究以及在POC上使用分子技术的研究获得成功，那么这种宿主生物标志物谱分析可能是解决难题的强大方法。

摘要

在此小型审查中，我们调查了POC测试的概况，其起源，当前应用范围的示例以及未来发展的需求。LFIA和POC分子分析的主要优势在于它们在初次就诊时提供诊断信息的能力。在患者的治疗选择对时间敏感并且检测结果会触发特定治疗或行动的情况下（例如，氟康唑对CrAg阳性艾滋病患者的治疗或非常小的婴儿的住院治疗），这些测试最有价值使用RSV）。当前的POC测试的主要弱点有时是在LFIA情况下临床敏感性低，而在POC分子测定的情况下既需要成本又需要基础设施。然而，如Urdea等。优雅地说，21）。可以在POC进行初步诊断的可访问且快速的测试是有效的患者护理，抗生素管理和疫情控制的强大工具。

致谢

感谢Jacqueline Scarbrough在从CMS数据库中提取CLIA豁免测试的数据方面提供的帮助。

这项工作的部分资金由NIH授予R33AI085548（授予TRK），R01AI093365（授予TRK），R41AI108114（授予TRK），R44AI109891（授予ARB-M。和TRK）和R43EB023408（授予ARB-M。和TRK）。资助者在研究设计，数据收集和解释或将作品提交发表的决定中没有作用。

内华达大学里诺分校已获得Immuno-Mycologics，Inc.的单克隆抗体许可，可用于构建CrAg LFA。根据大学政策，部分特许权使用费与TRKTRK共同拥有DxDiscovery的股权，DxDiscovery是一家专注于早期诊断开发的大学创业公司。ARB-M。是DxDiscovery的首席科学家。

·       版权所有©2017美国微生物学会。

开发出可快速检测传染病的发光试纸条！

原创 poct625 体外诊断POCT论坛  2019-03-16

一项新的研究中，来自荷兰埃因霍温科技大学和日本庆应义塾大学的研究人员开发出一种实用且可靠的检测传染病的方法。这种简单的技术使用了一种特殊的发光试纸条、一滴血和数码相机。它是价格廉价的和快速的---在20分钟后，就可清楚地知道是否存在感染；它还使得在医院进行昂贵且耗时的实验室测量变得不必要。此外，这种测试方法在发展中国家具有很大的潜力，可便于测试热带疾病。相关研究结果近期发表在Angewandte Chemie期刊上，论文标题为“Paper‐Based Antibody Detection Devices Using Bioluminescent BRET‐Switching Sensor Proteins”。

通过这种测试方法通过寻找血液中的对病毒和细菌作出反应而产生的某些抗体来展示传染病的存在。开发出检测抗体的便利测试方法作为医院中昂贵且耗时的实验室测量方法的一种实用且快速的替代方案而备受关注。医生也越来越多地使用抗体作为药物，比如，在癌症或风湿病的情形下。因此，这种简单的测试方法也适用于定期监测此类药物的剂量，并及时采取纠正措施。

图片来自Angewandte Chemie, doi:10.1002/anie.201808070。

开发出来的这种试纸条是很简单的：临床医生将一滴血加到这种试纸条上，等待20分钟，然后将它翻过来。论文共同通信作者、埃因霍温科技大学的Maarten Merkx教授说，“生化反应导致试纸条的下面发出蓝绿色光。颜色越蓝，抗体浓度越高。”数码相机（比如手机上的摄像头）就足以确定确切的颜色并因此确定测试结果。

颜色是由埃因霍温科技大学开发的一种发光的传感蛋白引起的。作为一种称为LUMABS的蛋白开关，这种蛋白对加入的一滴血作出反应，从而触发一种通过生物发光产生蓝光的反应。在第二步中，将蓝光转换为绿光。如果抗体与这种传感蛋白结合，那么它就阻止第二步发生。大量的绿光意味着很少的抗体，反之，绿色越少意味着更多的抗体。

蓝光与绿光之间的比率可用于获得血液中的抗体浓度。Merkx说，“因此，你不仅知道这种抗体是否存在于血液中，而且你还知道这种抗体的浓度是多少。”通过精确地测量这种比率，这种测试方法要比其他的生物传感器更加准确。在他们的原型中，他们成功地同时测试了三种抗体：一种针对HIV的抗体，一种针对流感病毒的抗体和一种针对登革热病毒的抗体。 Merkx预计这种测试方法将在几年内上市。